CRISPR Gen Düzenleme Nedir?
CRISPR gen düzenleme (/ˈkrɪspər/; “crisper” gibi telaffuz edilir; “kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleşmiş kısa palindromik tekrarlar”ın kısaltması), moleküler biyolojide canlı organizmaların genomlarının değiştirilebildiği bir genetik mühendisliği tekniğidir. Bakteriyel CRISPR-Cas9 antiviral savunma sisteminin basitleştirilmiş bir versiyonuna dayanır. Sentetik bir rehber RNA (gRNA) ile kompleks oluşturmuş Cas9 nükleazını bir hücreye ulaştırarak, hücrenin genomu istenen bir konumda kesilebilir, bu da mevcut genlerin çıkarılmasına veya in vivo (“canlı içinde”) yenilerinin eklenmesine olanak tanır.
Bu teknik, in vivo genom düzenlemeyi mümkün kılması ve son derece hassas, uygun maliyetli ve verimli kabul edilmesi nedeniyle biyoteknoloji ve tıpta büyük önem taşımaktadır. Yeni ilaçların, tarım ürünlerinin ve genetiği değiştirilmiş organizmaların oluşturulmasında veya patojen ve zararlıların kontrolünde kullanılabilir. Ayrıca kalıtsal genetik hastalıkların yanı sıra kanser gibi somatik mutasyonlardan kaynaklanan hastalıkların tedavisinde de potansiyel sunmaktadır. Ancak, insan germ hattı genetik modifikasyonunda kullanımı oldukça tartışmalıdır. Bu tekniğin geliştirilmesi, Jennifer Doudna ve Emmanuelle Charpentier’e 2020’de Kimya Nobel Ödülü’nü kazandırmıştır. Aynı keşif için Kavli Ödülü’nü paylaşan üçüncü araştırmacı grubu olan Virginijus Šikšnys liderliğindeki gruba Nobel Ödülü verilmemiştir.
CRISPR-Cas9 Nasıl Çalışır?
Genetik makas gibi çalışan Cas9 nükleazı, hedeflenen DNA dizisinin her iki ipliğini de açarak iki yöntemden biriyle modifikasyonu gerçekleştirir. Homolog yönelimli onarım (HDR) aracılığıyla kolaylaştırılan “knock-in” mutasyonları, hedeflenen genomik düzenleme yaklaşımlarının geleneksel yoludur. Bu, hedeflenen DNA hasarının ve onarımının başlatılmasına olanak tanır. HDR, onarım şablonu olarak işlev görecek ekzojen DNA’nın dahil edilmesi yoluyla kırılmanın onarımını sağlamak için benzer DNA dizilerinin kullanımını gerektirir. Bu yöntem, onarımın başlaması için hedef bölgede periyodik ve izole DNA hasarının meydana gelmesine dayanır. CRISPR-Cas9’un neden olduğu “knock-out” mutasyonları, çift sarmallı kırılmanın homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya POLQ/polimeraz teta aracılı uç birleştirme (TMEJ) yoluyla onarılmasından kaynaklanır. Bu uç birleştirme yolları genellikle onarım bölgesinde rastgele silmeler veya eklemelerle sonuçlanabilir, bu da gen işlevselliğini bozabilir veya değiştirebilir. Bu nedenle, CRISPR-Cas9 ile genom mühendisliği, araştırmacıların hedeflenen rastgele gen bozulmaları oluşturmasını sağlar.
Ökaryotik hücrelerde genom düzenleme, 1980’lerden beri çeşitli yöntemlerle mümkün olsa da, kullanılan yöntemler büyük ölçekli uygulamalar için verimsiz ve pratik olmayan bulunmuştur. CRISPR’ın ve özellikle Cas9 nükleaz molekülünün keşfiyle, verimli ve yüksek seçicilikte düzenleme mümkün hale gelmiştir. Streptococcus pyogenes bakteriyel türünden türetilen Cas9, crRNA ve tracrRNA rehber iplikleri tarafından belirlenen belirli bir konumda hedeflenen bir kırılma oluşturmak için güvenilir bir yöntem sağlayarak ökaryotik hücrelerde hedeflenen genomik modifikasyonu kolaylaştırmıştır. Araştırmacılar, belirli lokuslarda gen susturmak veya nokta mutasyonlarına neden olmak için Cas9 ve şablon RNA’yı kolaylıkla ekleyebilirler. Bu, çeşitli ökaryotlardaki çeşitli genlerle ilişkili genomik modellerin ve biyolojik süreçlerin hızlı ve verimli haritalandırılması için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır. Hedef dışı aktiviteyi önemli ölçüde azaltan yeni tasarlanmış Cas9 nükleaz varyantları geliştirilmiştir.
Uygulama Alanları ve Etik Tartışmalar
CRISPR-Cas9 genom düzenleme tekniklerinin birçok potansiyel uygulaması vardır. Genom düzenlemesi için CRISPR-Cas9-gRNA kompleksinin kullanımı, AAAS’ın 2015 Yılın Çığır Açan Buluşu seçimi olmuştur. 2015’ten bu yana, CRISPR, yaşayamayan insan embriyoları üzerinde deneysel olarak araştırılmıştır. 2019’da, tartışmalı He Jiankui olayı sonucunda, CRISPR tekniği kullanılarak genomu düzenlenmiş embriyolardan ilk insanlar doğmuştur. CRISPR’ın germ hattı düzenlemesi için kullanılması olasılığı hakkında, özellikle insan öjenizmini mümkün kılma potansiyeli olmak üzere çeşitli biyoetik endişeler dile getirilmiştir. 2023’te, CRISPR gen düzenlemesini kullanan ilk ilaç olan “Casgevy” markası altında satılan Exagamglogene autotemcel, Birleşik Krallık’ta orak hücre hastalığı ve beta talasemiyi tedavi etmek için resmi olarak onaylanmıştır. 2 Aralık 2023’te Bahreyn Krallığı, orak hücre anemisi ve beta talasemiyi tedavi etmek için Casgevy kullanımını onaylayan dünyadaki ikinci ülke olmuştur. 8 Aralık 2023’te Casgevy, Amerika Birleşik Devletleri’nde Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından kullanım onayı almıştır.
Alternatif Gen Düzenleme Yöntemleri: Çinko Parmak Nükleazları
2000’lerin başında, Alman araştırmacılar, DNA’ya bağlanan alanları sayesinde DNA’da belirli noktalarda çift sarmallı kırılmalar oluşturmalarını sağlayan sentetik proteinler olan çinko parmak nükleazları (ZFN’ler) geliştirmeye başladılar. ZFN’ler, Cas9’dan daha yüksek hassasiyete ve daha küçük olma avantajına sahiptir, ancak ZFN’ler CRISPR tabanlı yöntemler kadar yaygın olarak kullanılmamaktadır.